牙龈单胞菌诱导人白细胞脱颗粒的体外观察 -凯发k8网页登录

【摘要】目的：研究牙龈卟啉单胞菌及其可溶性毒力因子对人多形核白细胞的影响，探讨其导致慢性牙周炎发生的作用机制。方法：采集健康中老年人外周血，利用透射电镜观察多形核白细胞培养组(对照组)与牙龈卟啉单胞菌超声粉碎滤液共同培养组(实验组)多形核白细胞脱颗粒现象。结果：实验组多形核白细胞发生明显的形态学变化，而对照组细胞无明显变化;实验组脱颗粒白细胞百分数较对照组显著增多(p<0.001)。结论牙龈卟啉单胞菌可诱导多形核白细胞中颗粒向细胞周边移动并脱出，从而降低宿主的免疫能力,在慢性牙周炎发生中具有重要作用。

【关键词】牙龈卟啉单胞菌 多形核白细胞 细胞脱颗粒

慢性牙周炎在中老年人中的患病率极高，是导致中老年人群牙齿缺失的主要原因。牙龈卟啉单胞菌(porphyromonasgingivalis，p.g)是慢性牙周炎重要的可疑致病菌之一^①，可通过其可溶性产物对牙周组织造成损伤，而多形核白细胞(polymorphonuclearleukocytes，pmnls)是机体抵抗病菌入侵的第一道防线^②。在牙周炎发病过程中，宿主自身抵抗力的差异性是一个重要的因素，pmnls的功能正常与否，直接关系着机体免疫力的高低。研究发现：牙周致病菌与pmnls的相互作用在牙周病的致病机制中起重要作用^③④。目前针对p.g可溶性毒力因子对pmnls影响的系统研究较少，本研究旨在通过观察p.g超声滤液诱发pmnls脱颗粒的形态变化，探讨p.g可溶性毒力因子对pmnls的影响。

1、材料与方法

1.1 细菌菌种与研究对象

p.g标准菌株atcc33277(购自上海市口腔医学研究所)。选择10例健康老年人为试验对象，男女各5例，平均年龄(60±5)岁，所有受试者均知情同意。受试者的选择标准包括：无全身性疾病;近3个月无服用抗生素类药物;无活动性龋，牙周健康。

1.2 方法

1.2.1 细菌的培养及超声滤液的制备

将p.g接种在血液琼脂培养基中(营养琼脂加10%新鲜兔血)，10%co2的厌氧环境，37℃培养24h。将生长良好的细菌用生理盐水洗下，配置成2单位麦氏比浊管的浓度(6×108cfu/ml)，将该浓度的细菌置超声仪中超声粉碎(pg115型超声破碎仪，德国mse公司)，取上清进行过滤，滤过液置4℃保存备用。

1.2.2 外周血pmnls的分离培养

取10例健康老年人静脉血20ml，肝素抗凝后，用不连续密度梯度percoll分离pmnls。先将70%浓度percoll溶液缓慢加入试管中，再加50%浓度的percoll溶液，使之形成满意的界面。加抗凝血(约1.5ml)后离心25min，收取多形核细胞层，将细胞用不含血清的培养液洗涤2次，用含10%胎牛血清的rpmi1640培养液制成细胞悬液(5×106/ml)，37℃，5%co2孵箱中培养24h。

1.2.3 细菌超声滤液作用于pmnls

随机分为两组，实验组在pmnls内加入p.g超声粉碎滤液200μl，对照组的pmnls内加入rpmi1640培养液。在0、10、30和60min4个时间段进行电镜观察。

1.2.4 透射电镜样品的制备

将细胞悬液离心15min，沉积细胞经2.5%戊二醛固定，1%锇酸固定后，乙醇系列脱水，epon812环氧树脂包埋，超薄切片后用醋酸双氧及柠檬铅双重染色，透射电镜(jem1200ex)观察、摄片。

1.3 统计学分析 用spss11.5统计软件进行数据分析。采用成组设计两样本均数比较t检验。

2、结果

2.1 p.g超声滤液诱发pmnls脱颗粒的形态变化

电镜观察显示：对照组中各时间点pmnls形态完整，细胞浆内无明显颗粒，细胞膜边缘整齐，细胞核呈分叶状、饱满(图1a)。而实验组中pmnls在p.g超声滤液作用10min时，细胞内有明显的颗粒聚集并向细胞周边移动的现象(图1b)，在30和60min时，pmnls出现脱颗粒现象，同时伴有细胞不完整，细胞膜不光滑，细胞核皱缩的现象(细胞凋亡出现)，甚至出现细胞裂解死亡。

2.2 脱颗粒的pmnls与正常pmnls百分数的比较

p.g的超声滤液加入pmnls后在0、10、30、60min4个时间点利用电镜观察。结果显示：在10、30和60min3个时间点变现出差异，实验组在10min时脱颗粒的pmnls增多，在之后的时间里得到了持续，而对照组波动较实验组稳定。两组脱颗粒的pmnls数

3、讨论

老年人的牙周附着丧失重于年轻人，慢性牙周炎多见于中老年人。牙龈卟啉单胞菌是目前公认的牙周致病菌之一，也是牙周微生物领域重点研究的厌氧菌之一，与慢性牙周炎、侵袭性牙周炎、牙周脓肿和牙髓感染以及伴发性全身性系统疾病密切相关^⑤⑥。病原菌致病是一个多因素共同作用的过程，有参与基本生理过程的看家基因和多种毒力基因参与。p.g基因的多态性与复杂性使得其致病机制迄今尚不明了，已发现的p.g的毒力因子包括菌毛、牙龈素、脂多糖(lps)等^⑦⑧。

pmnls是机体免疫防御系统的重要组成部分，既是白细胞中功能最活跃的多功能细胞，也是参与炎症反应的主要细胞。pmnls具有吞噬作用，能够在感染组织中迁移,预防炎症的扩散，是细胞免疫和体液免疫的积极参与者，主要通过释放多种蛋白水解酶而发挥杀菌功能^⑨。当pmnls不能正常行使其功能时，细菌不仅不会被杀死，而且可以抑制溶酶体和吞噬体的融合。即便是pmnls的吞噬能力正常，但对趋化性反应迟钝，不能游走至趋化因子刺激的部位，会使感染经久不愈。pmnls的杀菌作用主要依赖于吞噬溶酶体中颗粒成分所调节的非氧化机制。颗粒成分的细胞外释放可能抵消pmnls内杀伤作用，降低局部的免疫防御功能和屏障作用。导致溶酶体成分细胞外分泌的主动过程为细胞支架的聚合，它是颗粒向细胞周边的转运机制^⑨。此外，脱颗粒将导致牙周组织内溶酶体混合成分浓度的增加，它不仅有害于宿主细胞，而且还可以参与牙周组织的病理过程加剧炎症反应^⑩。

将p.g用超声波粉碎机粉碎，滤液内会含有该菌的绝大部分可溶性毒力因子。研究这种滤液既可以避免菌体本身的不确定性又能避免单一成分的不完整性，是一种方便、可靠的有效途径^④。本实验将p.g超声粉碎滤液与健康中老年人外周血中的pmnls共同培养,结果发现：实验组(在pmnls中加入p.g超声粉碎滤液)和对照组(在含抗毒血清的pmnls中加入p.g超声粉碎滤液)存在显著差异，实验组脱粒的pmnls百分数明显高于对照组，同时随时间的延长，脱颗粒现象更加明显。

本研究认为，p.g的超声粉碎滤液能够使健康中老年人外周血中的pmnls发生脱颗粒，从而通过降低宿主的免疫功能导致牙周炎的发生、发展。值得注意的是，口腔是一个多种微生物定植的微生态系统，各种微生物之间相互依存、相互制约，不能单纯的用单一致病菌对组织的损害来说明口腔微生物群的作用。此外，不同个体的pmnls的自身存在功能的差异，是否会对研究结果产生差异，还需在今后的工作中进一步研究。

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