颅内动脉瘤的mmp-凯发k8网页登录

【摘要】目的:探讨基质金属蛋白酶9(mmp-9)对脑血管壁细胞外基质(ecm)破坏在颅内动脉瘤发病机制中的作用。方法:对15例颅内动脉瘤标本和6例非脑血管病病人的正常脑血管，应用实时荧光定量pcr检测脑血管壁组织内mmp-9mrna的基因表达水平，并通过电镜观察颅内动脉瘤病人血管壁细胞及ecm的形态学变化。结果:动脉瘤壁组织中mmp-9mrna的表达是正常脑血管的10.06倍(p<0.01)。电镜下见动脉瘤壁内皮细胞损伤，中层平滑肌细胞数目明显减少并呈凋亡状态，ecm严重破坏;而正常脑血管壁细胞及基质纤维清晰可见，结构完整。结论:颅内动脉瘤壁组织中mmp-9的基因表达水平显著升高，并可能通过破坏ecm和诱导平滑肌凋亡参与颅内动脉瘤的发病机制。

【关键词】颅内动脉瘤 明胶酶b 细胞外基质 显微镜检查 电子 透射

近年来，国内外研究发现：动脉瘤壁组织中过度表达的基质金属蛋白酶9(mmp-9)通过破坏脑血管壁的细胞外基质(ecm)参与颅内动脉瘤的发病。有关诱发mmp-9过度表达通路的研究较多[1-3]，但对其破坏ecm超微结构研究的报道甚少。为此，我们对颅内动脉瘤标本应用实时荧光定量pcr检测瘤壁组织内mmp-9mrna的基因表达水平，通过透射电镜观察血管壁细胞及ecm超微结构的形态学变化，并与正常脑血管进行比较，报道如下。

1、材料与方法

1.1 标本来源 15例颅内动脉瘤标本来自四川大学华西医院神经外科近年来经开颅手术，在顺利夹闭动脉瘤并保证病人安全的前提下获取;男3例，女12例;平均年龄55岁(动脉瘤组)。同时取6例非动脉瘤病人的脑血管作为对照组，所有标本均经华西医院病理科明确诊断。

1.2 实时荧光定量 pcr检测

1.2.1 主要试剂：总rna提取试剂(trizoltotalrnaisolationreagent，gibcobrl，usa)、rt-pcr试剂盒(mbi公司，lithuania)、pcr试剂盒(mbi公司，lithuania)、taq酶(mbi公司，lithuania)、dntp(mbi公司，lithuania)、引物根据ncbigenebank中的人mmp-9cdna序列(nm：004994，gi：4826835)，按照5'端相同、3'端互补的原则，兼顾tm值、g c含量等因素进行设计合成、纯化，用无rnase的灭菌双蒸水溶解为10mmol/l。探针由上海生工生物工程公司合成和检测。根据甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)mrna原始序列设计合成gapdh(nm：002046，gi：7669491)特异的引物与探针，上游引物：5'-gggtgtgaaccatgagaagt-3;下游引物：5'-ccaaagttgtcatggatgacct-3'。

1.2.2 pcr反应体系和条件：mix94℃2min变性后，进行热循环;94℃20s、53℃30s、60℃40s收集荧光，循环次数：45次。

1.2.3 总rna提取和mrna分离：trizol法提取标本细胞，总rna紫外分光光度计分析其纯度，并电泳验证mmp-9条带。

1.2.4 制作mmp-9基因的标准曲线：按程序进行相应模板的pcr反应和获取荧光定量pcr，结果制作成mmp-9基因的标准曲线。将各待测样本靶基因的相对ct值减去内对照gapdh的ct值，获得校正后的相对δct值，进行统计学分析。

1.3 统计学处理 采用spss11.5统计软件对两组样本均数行t检验。同时比较动脉瘤组织中mmp-9与正常对照组表达水平的倍比关系。

1.4 形态学观察 新鲜标本经3%戊二醛预固定，1%四氧化锇再固定，丙酮逐级脱水，epon812包埋，半薄切片光学定位，超薄切片6μm，醋酸铀及枸橼酸铅双重染色，行h-600iv型透射电镜观察。

2、结果

2.1 mmp-9mrna在不同脑血管内的表达水平

2.2 电镜结果 颅内动脉瘤组：内皮细胞损伤，可见细胞固缩或空泡变性，中层平滑肌细胞数目明显减少，多数细胞核固缩，染色质边聚，可见凋亡小体，部分线粒体肿胀，正常内部结构消失，构成细胞骨架的ecm模糊不清，呈无定形的絮状物质，细胞缺失的部位有较多碎片(图1);而正常对照组脑血管壁基质纤维清晰可见，结构完整。

3、讨论

颅内动脉瘤的发病机制目前尚未完全清楚，通常认为是遗传学、异常血流动力学以及血管壁后天退行性变等多种因素综合作用的结果。国内外的研究发现：基质金属蛋白酶(mmps)，尤其是mmp-9与颅内动脉瘤的形成关系极为密切。刘兵等[4]运用免疫组化sp法和实时pcr检测大鼠血管平滑肌细胞内mmp-9表达情况，结果发现：联合应用细胞因子il-1α和血小板源性生长因子-b(pdgf-b)能够诱导mmp-9表达，降解胶原蛋白;结合颅内动脉瘤病人血管壁上有明显的炎性细胞浸润及其分泌的大量细胞因子，因此认为：过量表达的mmp-9参与了颅内动脉瘤的发生、发展乃至破裂。1997年，kim等[1]研究颅内动脉瘤夹闭后手术切除标本发现：动脉瘤壁上mmp-9表达明显升高，而血浆和对照组颞浅动脉壁未见升高。gaetani等[5]研究发现：动脉瘤壁局部(而非全部)的mmp活性变化参与了颅内动脉瘤的形成和破裂。韩利江等[6]应用原位杂交技术检测5例脑动脉瘤病人mmp-2mrna和mmp-9mrna的表达情况，结果发现：mmp-9mrna在所有颅内动脉瘤标本中均有表达，阳性杂交信号密集存在于内膜，尤其是内弹力层。sehba等[7]通过研究大鼠颈内动脉颅内分叉部穿孔诱导的蛛网膜下腔出血模型，结果发现：微血管内mmp-9表达水平在局部升高的同时伴随ⅳ型胶原减少或消失。本研究结果也显示：颅内动脉瘤中mmp-9mrna表达水平显著性高于对照组(p<0.01)，说明过度表达的mmp-9可能参与了颅内动脉瘤的形成。

基质金属蛋白酶(mmp)家族可由内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和巨噬细胞等多种细胞以非酶原形式合成分泌，其主要功能是降解构成ecm的胶原蛋白、弹性蛋白和非胶原糖蛋白，其中以mmp-9对ecm的破坏性最强[8]。本研究通过透射电镜观察到，动脉瘤血管壁内皮细胞呈固缩或空泡变性，内弹力板疏松分层或完全消失，血管壁平滑肌细胞大量凋亡，中膜主要由数量不等的纤维细胞构成，纤维细胞之间为大片胶原及无定形的絮状物质，说明过度表达的mmp-9对ecm的破坏使血管壁变薄膨出，可能是颅内动脉瘤形成及破裂的重要机制之一。

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