荧光定量pcr测定水杨酸钠作用后大鼠耳蜗基因的表达 -凯发k8网页登录

1、资料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物的选择及处理 成年健康正常wistar大鼠(湖北省预防科学院动物实验中心)30只，体重180～200g，雌雄不拘，耳郭反射阳性，无强噪声暴露及耳毒性药物使用史。适应性饲养7d后，分为两组：实验组15只，200mg•kg-1乙酰水杨酸钠肌注，2次/d，其间间隔8h，连续注射14d，在第15d迅速断头取耳蜗;对照组15只,每天等量生理盐水肌注,与实验组同时剥取耳蜗。

1.1.2 要试剂和仪器 rizol(lifetechnology公司,美国)、mmlv逆转录酶(lifetechnology公司,美国),pcr试剂(takara公司,日本),sybrgreeni染料(molecularprobes公司,美国),rotorgene3000荧光定量pcr仪(corbettresearch公司,澳大利亚)。

1.2 方法

1.2.1rna提取和cdna合成 将正常组和水杨酸钠作用组的大鼠，分别剥离耳蜗，再在显微镜下去掉骨质外壳，将其内容物匀浆，然后用trizol法(lifetechnologies公司)抽提总rna。取1μg的总rna,用mmlv逆转录酶,按照其说明书进行cdna的合成,-20℃保存。

1.2.2 引物大鼠基因 hsp27引物，上游引物:5′caaggaaggcgtggtggaga3′;下游引物:5′tggtgacggctactggggat3′，产物长度311bp。大鼠βactin引物，上游引物:5′ttgtaaccaactgggacga;atgg3′;下游引物:5′gatcttgatcttcatggtgct;agg3′产物长度:764bp。

1.2.3 实时定量pcrsybrgreeni(molecularprobes)原液存储 在二甲基硫氧化物中,初始浓度为10000倍,将其稀释为50倍作为工作液,分装后,-20℃避光保存。

1.2.3.1 大鼠βactin的pcr反应 引物0.5μmol•l-1,dntp0.2mmol•l-1,mgcl23mmol•l-1,taq酶1u,sybrgreeni0.5倍，1×pcrbuffer,总体积为25μl，循环：94℃变性3min,开始循环：94℃30s,56℃30s,72℃50s,72℃5s检测荧光，共40个循环。

1.2.3.2 大鼠hsp27的pcr反应 引物0.5μmol•l-1,dntp0.2mmol•l-1,mgcl23mmol•l-1,taq酶1u,sybrgreeni0.5倍，1×pcrbuffer,总体积为25μl，循环：94℃变性3min,开始循环：94℃30s,55℃30s,72℃40s,72℃5s检测荧光，共40个循环。

1.2.4 基因表达的定量分析 采用livak等设计的比较阈值法来测定目的基因的相对表达，目的基因的量=2^^ct，在该公式中ct是热循环仪检测到反应体系中荧光信号的强度值，δδct=(ct,目的基因ct,管家基因)实验组(ct,目的基因ct,管家基因)对照，所以，2^^ct表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数，使用这一方法可以直接得到的目的基因相对于管家基因的定量。

1.3 数据收集及统计学处理 数据收集主要由rotorgene3000自带软件完成。通过软件计算出所有样本，包括目的基因和管家基因的起始循环数(ct),用公式法计算目的基因的量。采用spss11.0软件进行统计学处理，p<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

大鼠耳蜗目的基因hsp27和内参基因βactin扩增完成后，以1.5%琼酯糖凝胶电泳进行产物鉴定(图1、2);水杨酸钠作用组和正常对照组的hsp27基因和βactin在各自的反应条件下进行荧光定量pcr测定，反应结束后,通过电脑分析,直接得出定量结果;慢性水杨酸钠作用组内参基因βactin和目的基因hsp27的起始循环数(图3、4);实验组和对照组中目的基因和管家基因的起始循环数及其计算结果，并经t检验，p<0.01，两组对照其差异有统计学意义。由表1可知慢性水杨酸钠注射后(实验组)大鼠耳蜗中hsp27的基因表达增强,是对照组的3.16倍。

3、讨论

hsp27是hsp家族中小分子量热休克蛋白(shsp)亚家族中的一员,分子量为27kd[2]，分为构成型和诱导型。以往的研究已经表明，hsp27家族除了参与调节细胞的生长、分化及作为分子伴侣保护细胞功能之外，还参与微丝的稳定与细胞信号转导，防止应激后肌动蛋白(actin)微丝碎裂,调节factin多聚化,影响细胞骨架及细胞迁移等。

leonova等[4]报告，hsp27在正常大鼠耳蜗内主要存在于外毛细胞的侧壁、顶部、reissner′s细胞膜等，在我们前期的研究中也得出了相同的结果[5]。外毛细胞是听觉过程中机械-电能转换的部位，其外侧壁由三部分组成，最外层为细胞质膜层(protoplasmicmembrane，pm)，中间为富含肌动蛋白的细胞骨架网(cytoskeleton，cl)，最内层为细胞表面下池(subsurfacecisternae，ssc)。正常耳蜗功能的维持与外毛细胞尤其是外侧壁结构的完整性密切相关，因此，leonova等推测hsp27在正常大鼠耳蜗中持续表达，其作用可能是维持和稳定外毛细胞肌动蛋白细胞骨架，从而对抗外毛细胞在正常听觉过程中所受到的机械应力。

hsp27基因在启动子区有热休克调节元件(heatshockregulatoryelement,hse)及应激相关调节元件(stressrelatedregulatoryelement,stre)，其表达受热休克转录因子1(heatshocktranscriptionfact1,hsf1)的调控。hsf1在大鼠耳蜗内的分布与hsp27的表达部位一致，但位于细胞核内。在非应激状态细胞内hsf1以非活性的单体形式存在，非活性hsf1经三聚化和丝氨酸磷酸化在应激条件下(如耳毒性药物，噪声损伤等)激活，活化的hsf1与hsp27基因中应激相关调节元件结合，从而激活hsp27基因,使其增加。kazuma等[6]研究发现，hsf1基因敲除鼠虽然听力正常，但在应激条件下热休克蛋白的表达不再增加。

关于水杨酸钠耳毒性作用，cazals等[7]通过对听觉电生理的研究发现，水杨酸钠能引起可逆性的耳蜗复合动作电位阈值升高及耳声发射幅值下降或升高，提示水杨酸盐耳毒性的主要作用部位在耳蜗、特别是外毛细;形态学方面，罗燕云等[8]指出，慢性水杨酸钠注射2周豚鼠耳蜗外毛细胞出现了ssc扩张性空泡形成，同时外毛细胞静纤毛柔软、弯曲，表皮板局部溶解。allen等[9]报告，离体外毛细胞在不同浓度的水杨酸钠溶液中其外侧壁的硬度显著降低，认为这与水杨酸钠对外侧壁质膜层和细胞表面下池的直接损伤相关。外毛细胞及静纤毛顺应性的改变导致静纤毛与盖膜失耦合，引起膜离子通道异常开放，一方面可能导致静纤毛异常摆动的机械能转换成电能而传入，另一方面可能通过盖膜与内毛细胞较长静纤毛的紧密接触而影响到内毛细胞，使内毛细胞兴奋性增强，异常电信号传入。在缺乏外界声刺激时，异常电信号传入引起听觉通路上自发活动增强[11]，引起耳鸣。

在本实验中，我们比较了慢性水杨酸钠作用后与正常对照组之间耳蜗组织中hsp27基因表达变化，结果表明，长期大剂量水杨酸钠注射后大鼠耳蜗中hsp27基因表达明显增强，达到3.16倍。我们前期的研究表明[5]，慢性水杨酸钠作用后hsp27表达增强的主要部位为外毛细胞。hsp27表达增强可能是对外毛细胞进一步损伤的保护，防止应激后肌动蛋白微丝碎裂，稳定外毛细胞的细胞骨架[12]。水杨酸钠是直接激活hsf1而启动hsp27基因表达，还是在损伤过程激活hsf1其机制还有待进一步的研究。

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